（前編はこちら）

ケース③ 真打登場！ 担子菌黒雪さんたちの場合

　寒さと担子菌と言えば、ガマノホタケであり、その中でも黒雪さんたちが、その代表である（キッパリ）^*22。しかし、黒雪さんたちでさえ凍結は苦手なのだ（図6）。菌糸成長がかなり遅くなる^*23。それゆえ黒雪さんたちは、凍結を避けるためかなりのコストを払っている。菌糸の周囲が凍りづらく、凍ってもすぐ溶けるように自らの環境を改良している。いやいや、一介の菌類が、そんな環境の改良なんて、なんて大げさな、と思うあなた。いえいえ本当なんです。以下の段落をご笑読あれ。

 

 

図6．黒雪さん危機一髪！ 凍結すると死ぬことはないが成長は遅くなる。

 

　ちょっと話題がそれるが、氷山の下にも魚がいる。海水は、塩水なので0℃ではなく-1.8℃で凍結する（これは高校の化学で習う凝固点降下^*24による）が、夏に釣り上げた魚の血液は-0.7℃で凍ると言う。まあ、成分が違うのだから凍る温度も海水と違うよねえと思うが、ちょっと変だ。それなら海が凍る前に、魚が凍ってしまう。しかし、氷下魚こまい（これの干した奴は酒のつまみに最高です）なんて魚がいるように、彼らは（表情筋が少ないかもしれないが）平気な顔で氷の下を泳いでいる。

　これにはからくりがある。魚たちは海氷の時期、不凍タンパク質^*25（antifreeze protein：以下AFPと略称）と呼ばれる特殊なタンパク質を血液や体表を覆う粘液中に蓄積し、体液の凍結温度を-2.0℃まで下げることで、血液の凍結を回避している（図7）。このことがわかったのは、1950年台だ。

 

図7．氷山の下で泳ぐ魚たちは、特殊なタンパク質を蓄積して血液の凍結を回避している。原図提供：三浦和則博士。

 

　ではAFPは、どのようなメカニズムで魚の血液を凍りにくくしているのだろうか？　血液中に氷ができても、その結晶が小さなうちに、AFPはこれに張り付き、覆ってしまう。AFPに覆われた氷結晶は新たに水分子を取り込むことができなくなる（図8）。これにより、氷結晶は、成長（大きくなる）せず、その結果、溶液は凍らない。
　氷の単結晶（1つの氷が、1つの結晶からできていること）は、図8のように上下２つの六角形の面とこれを取り巻く6つの長方形の面でできている。通常、単結晶の氷は成長する過程で、無数に枝分かれした多結晶（雪の結晶をイメージしてほしい）に変化し、見た目、丸い氷ができる。魚のAFPは長方形の面に張り付き、これを覆ってしまう。氷結晶は六角形の上下のみ成長し、AFPがこれを覆ってしまう。これを繰り返すことでピラミッドを底面で重ねたバイピラミダル型と呼ばれる特殊な形の氷結晶を形成する。そしてAFPは魚の専売特許ではなく、低温環境に生きる様々な生物から発見されている。昆虫のAFPは六角形の上下の面にも結合できるため、さらに効果が高い。そして無論ここに菌類も含まれている^*26。

 

 図8．魚の不凍タンパク質AFPの効果。正確には底面が六角形なので、底面が四角形のピラミッドとは形が違う。ただ階段状の構造は似ていると思う。切手紹介4に実際に底面でピラミッドを無理やり合わせた図を示した。原図提供：高道学博士・三浦和則博士・津田栄博士。

 

　私は当初、黒雪さんたちなら細胞の凍結を回避するために細胞内にAFPを蓄積していると思っていたし、そのような先行文献もあった^*27が、後にガセネタだとわかった。しばらくして競争相手でもあり、友人でもあるカナダのTom Hsiang教授たちのグループが、数種のガマノホタケの培養液を凍らせると、AFPと考えられる氷結晶の変化が見られると報告した*²⁸。
　細胞外にAFPが分泌されるのか？　文章を目で追い、脳内で処理された思わぬ情報に、マブイが落ちかかったと言うか、六文銭を握ったまま、カムイの前庭がうっすら見えたくらいの衝撃だった。

　AFPは水を凍りにくくする機能をもったタンパク質だ。機能をもつタンパク質の代表として様々な反応を触媒する酵素がある。だが酵素はAFPと大きな違いがある。酵素は“ピン”で働くのに対して、AFPには“集団行動”が求められる。細胞外に分泌された酵素は基質を分解しながら、細胞周囲に拡散していく。それでも壊れてしまうまで律儀に働き続ける。一方、AFPは氷の表面を全て覆ってしまうことで、氷の成長を妨げる。少しでもAFPが付かない場所あれば、そこから氷が成長する。つまりAFPがきちんと働くためには、一定の濃度が必要だ。
　細胞の外に分泌されたAFPはなすがままに拡散し、希釈されてしまうかもしれない。生物はそんな無駄をしないだろうと私は思っていた。だがじっくり考えると、魚も体内であるが細胞外の血液に、植物同様に細胞と細胞の間のアポプラスト（細胞膜外側の水溶液に満たされた空間）にAFPが存在している。細胞外の氷をどうこうするために、皆AFPを備えているのだ。

　早速、雪腐病菌の培養液を凍らせると、ガマノホタケたち担子菌にのみ特徴的な氷の形が見えた^*29。ガマノホタケの中で、黒雪さん・茶雪さん（T. incarnata）・赤柄さん（T. phacorrhiza）の順に寒さを好むことは、先に記した。AFPによる氷結晶の変化の度合いもこの順に強くなる。黒雪さんの作る氷は、黒曜石でできた打製石器のような独特な形をしている（写真1）。こんな形の氷は、当時誰も報告していなかった。擬人的な比喩を用いれば、黒雪さんは考えているのだろう。彼女たちの菌糸成長の最適温度10℃は、凍る温度ではないからだろう、AFPの効果は弱かった。
　一方、凍るかも！と思われる0℃で培養すると、明らかな効果が確認された。それぞれの温度で培養した液体培地中のタンパク質を電気泳動によって分析すると、10℃では培地中のタンパク質はほとんど見られない。しかし、0℃で培養した培地にはくっきりと分子量2万くらいの位置にタンパク質の存在が確認された（図9A）。そしてあれやこれやと操作して、不純物を除き菌類のAFPを初めて精製した。

 

 

写真1．黒雪さんの培養液やAFP溶液を凍らすとこんな氷が見える。 A：培養前の培養液、 B: 0℃で2ヶ月培養した黒雪さんの培養液。まさに打製石器。 C：培養初期の培養液や低濃度（4 µM）のAFP溶液では、氷結晶が六角形や星形になる。 D：高濃度（50 µM）のAFP溶液では温度を下げても△で示す種氷がしばらくは全く成長せず、ある温度以下になると急激に雪の結晶のように凍結する。この性質は、氷結晶の全面を覆うことができる性質と同じである。出典：鈴木啓太 2008. 好冷性担子菌Typhula ishikariensis由来不凍タンパク質の機能解析．北海道大学大学院理学院生命理学専攻修士論文を基に作成。

 

図9．黒雪さんはAFPで凍結環境を一点突破する気らしい。 A：培地の電気泳動写真．kDaは分子量のこと。10 kDa =1万となる。0℃で培養すると▲で示す分子量2万程度のタンパク質が蓄積していることがわかる。また、凍らない温度10℃ではこのタンパク質はほとんど見られない。 B：黒雪さんを小麦に感染させ、食事風景を観察すると……この倍率なら菌糸は、写真右下の白矢印くらいに見えるはずなのだが、なにやらめちゃくちゃ粘っこいものをまとっている（△）。画面奥の小麦の葉に菌糸が侵入する際、多糖が張り付いて、べちゃ、とか音が聞こえそうだ。写真中央はなにやら多糖がドーナツ状に張りついて担子菌特有のかすがい連結のように見えるが（だからこの場所を撮影した）、実際はわからない。
出典：T. Hoshino, M. Kiriaki, S. Ohgiya, M. Fujiwara, H. Kondo, Y. Nishimiya, I. Yumoto, S. Tsuda 2003. Antifreeze proteins from snow mold fungi. Canadian Journal of Botany 81: 1171−1181, T. Hoshino, N. Xiao, Y. Yajima, K. Kida, K. Tokura, R. Murakami, M. Tojo, N. Matsumoto 2013. Ecological strategies of snow molds to tolerate freezing stress. In Plant and Microbe Adaptations to Cold in a Changing World: Proceedings of the Plant and Microbe Adaptation to Cold Conference, 2012 (R. Imai, M. Yoshida, N. Matsumoto eds) Springer, New York, 285−292を基に作成。

 

　植物には、AFPと酵素の2つの機能をもつタンパク質の存在が知られている^*30。当初、私は黒雪さんのAFPもこれと同じでなにか別の機能もあるだろうと考えていた。なにせ培地中に存在するタンパク質の95%以上はAFPという異常事態だ。黒雪さんは、かなりのエネルギーをAFP生産に費やしている。あんた一体、どんだけ凍りたくないのよ。凍らせないだけのために、これだけのコスト払わないでしょと思い、考えられる酵素活性の測定をしてみた。うーん。活性がない。そうこうするうちに黒雪さんのAFPの遺伝子を見つけた^*31。それは魚とも、虫とも植物のAFPとも、縁もゆかりもないモノだった（収斂しゅうれん進化と呼ぶ分子レベルでの他人のそら似）。さらに黒雪さんのAFPの形を精密に測定すると、やはり酵素ではなかった^*32。

　黒雪さんは、タンパク質として4種類、遺伝子としては11種類以上のAFPを持っている。遺伝子の数を増やしてAFPをとにかくたくさん作る作戦に賭けているのだろう。作っても菌糸の周りから拡散してしまうからなあと思っていたが、食事の様子を観察して気づいた。菌糸が服を着ている！
　液体培地で培養すると確かに菌糸体の周りにどろっとした透明の多糖が付いてくる。小麦をお食事中の黒雪さんの菌糸は、多糖をまとって随分と太く見える（図9B）。細胞外に分泌されたAFPの大半はここに留まり、菌糸周囲に凍りにくい、あるいは凍っても溶けやすい環境を創っていると考える。まさに黒雪さんの勝負服なのだろう。実際、低温室を0℃に設定して、黒雪さんを培養していたとき、シャーレが凍ったことがあった。シャーレの蓋に付いた霜が落ちたのだろう。シャーレを手に低温室内の蛍光灯に透かして見ると、菌糸の周りはわずかだが凍っていないように見えた。

 

　ボレアリスと黒雪さんは、同じ雪の下にすむ赤の他菌だ。始めはピシュウムたちを含め雪腐病菌に至る共通の道があったように見える。しかし、交差した道はまた分かれ、それぞれに進化している。得手不得手があり、どちらが凄いとは一概には言えない。ピシュウムたちとボレアリス、それから黒雪、みんなちがって、みんないい。と吟じてみたい。

 

 

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*22 これはきのこに限ってのこと。酵母には南極陸上生態系の最大勢力であるMrakiaという別のスーパースターがいる。M. Tsuji, S.Fujiu, N. Xiao, Y. Hanada, S. Kudoh, S. Tsuda & T. Hoshino 2013.FEMS Microbiol. Lett. 346: 121-130. 星野保，辻雅晴，横田祐司，工藤栄，内海洋，湯本勲2016生物工学94: 329−331.

*23 T. Hoshino, N. Xiao, O.B. Tkachenko 2009. Mycoscience 50: 26−38.

*24 水に塩や砂糖を溶かすとその濃度に応じて凍る温度（凝固点）が下がる現象。ちなみに沸点は上昇するよ。

*25 魚の体液も実際温度を下げていけば凍るので、不凍タンパク質とは言い過ぎでないかとの意見もある。また、植物のAFPのように凍り方を制御することが重要な場合もあり、近年は氷結晶結合タンパク質（ice-binding protein：IBP）とも呼ばれている。英語だとあまり感じないのだが、日本語の氷結晶結合……うーん、だいぶ物の言いが堅くて日常会話には登場しない気がする。

*26-1 冬期に野外で採集した4種のきのこ（いずれも担子菌：ヒラタケ・エノキタケ・カワラタケ・キウロコタケ属菌）、3℃で培養した2種の好冷性真正細菌（Micrococcus cryophius，放線菌Rhodococcus erythromolis）の細胞抽出液より、熱ヒステリシスを報告したことに始まる（J.G Duman & T.M. Olsen 1993. Cryobiology 30: 322-328）。

*26-2 熱ヒステリシスとは、氷が融ける温度（融点）と水が凍る温度（凝固点）が異なる現象。普通、水は（過冷却がかからないようにすれば）0℃で凍り、氷は0℃で溶ける。しかし、AFPを含む水は融点＞凝固点となり、凍りにくく、溶けやすくなる。

*27 W.J. Newstead, S. Polvi, B. Papish, E. Kendall, M. Saleem, M. Koch, A. Hussain, A.J. Cutler & F. Georges 1994. Biochem. Cell Biol. 72: 152-156. この論文には分子量3千程度の魚類AFPの抗体と反応する同じ分子量のタンパク質が、雪腐病菌の細胞内に存在すると記されていた。運よくカナダからこの抗体を分けていただいて実験すると、黒雪さんたちの細胞内では、分子量3万（既報より10倍大きい？）のタンパク質と反応することがわかった*¹⁷。おまけにこの抗体と反応するタンパク質は、凍結耐性の高い北極の菌株に多く、より南の菌株は細胞内濃度が低かった。これは私の作業仮説に都合がよく、しばらくこれが黒雪さんのAFPと信じていた*¹⁷。

*28 C.S. Snider 2000. Phytopathology 90, 354-. この論文の1年前に出版された、米国植物病理学会の要旨集を見たときだ。

*29-1 T. Hoshino, M. Kiriaki, S. Ohgiya, M. Fujiwara, H. Kondo, Y. Nishimiya, I. Yumoto, S. Tsuda 2003. Can. J. Bot. 81: 1171-1181.
　Hoshino, M. Kiriaki, T. Nakajima 2003. Cryo-Lett. 24: 135-142.
　Hoshino, N. Xiao, O.B. Tkachenko 2009. Mycoscience 50: 26-38.

*29-2 ただし、これは雪腐病菌限り。北海道や南極で採集した菌類では、コウノウマクキン（ツボカビに近いグループ）、接合菌や子嚢菌、地衣類やはては卵菌までさまざまな菌類からAFPの存在が確認されている。
　新井達也，星野保 2018. 8章 微生物由来不凍タンパク質．『不凍タンパク質の機能と応用』（津田栄監修），シーエムシー出版，東京，pp. 96-103．

  

写真3．南極産菌類の培養液が示す多様な氷結晶。左から順に卵菌未同定種、コウマクノウキン未同定種、子嚢菌Antarctomyces psychrotrophicus、担子菌酵母Glaciozyma antarctica。出典：Nan Xiao, Shigeki Inaba, Motoaki Tojo, Yosuke Degawa, Seiichi Fujiu, Yuichi Hanada, Sakae Kudoh & Tamotsu Hoshino 2010. Antifreeze activities of various fungi and Stramenopila isolated from Antarctica. North American Fungi 5 (5): 215-220を基に作成。卵菌やコウマクノウキンの培養液が作る氷結晶正面の不思議な模様はいかなるメカニズムなのだろうか。
　また、黒雪さんのAFPと同じ遺伝子が、細菌・藻類・原生動物はてはプランクトンサイズの動物から見つかっている。これは遺伝子の水平伝播と呼ばれる現象で、異なる生物種間を遺伝子が移動することを示している。これにもウイルスが一枚も二枚もかんでいると考えられている。この現象は、生物進化に大きな影響を与えていると共に、自然界でも遺伝子組換えが起きていることを示している。典型的な例は、ビール酵母の誕生だと思う（和文の解説は、大室繭 2016. 生物工学会誌 94: 562）。

*29-3 一方、南極を始め世界中の氷河に見られるMrakia属酵母はAFPを作らない。そもそも遺伝子がないのだ（M. Tsuji, S. Kudoh, T. Hoshino 2015. Genome Announc. 3: e014554-14）。Mrakia属酵母は、菌類がAFP獲得前の寒さに生きる姿を見せてくれるのだろうか？　あるいはAFPを必要としないほど進化したのだろうか？

*30 M. Griffith & M.W. Yaish 2004. Trends Plant Sci. 9: 399-405.

*31 この遺伝子は当初、シイタケのもつ機能未知遺伝子として香港大学の研究者によってデータベースに登録されていた（J.A. Raymond & M.G. Janech 2009. Cryobiology 58: 151-156）。私たちの発見は、機能からこの遺伝子にたどり着き、真の名を見出したところにある（お！ 我ながらこの個所、ゲド戦記あるいは崖の国の大地学者的で良い）。近年、ゲノム解析によるビッグデータの蓄積が著しいが、機能未知の原石が大量に積みあがっている。これをどうするか問題も山積みだ（地道な解析じゃ追いつかない）。

*32 H. Kondo, Y. Hanada, H. Sugimoto, T. Hoshino, C.P. Garnham, P.L. Davies, S. Tsuda 2012. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109: 9360−9365.

 

ある菌類学者の成長の記録④．年代物の顕微鏡を手にポーズを決める。1995年の国際学会にて。この顕微鏡は、オランダの微生物学者Martinus Willem Beijerinck博士の愛用品であり、日本語版wikiの肖像と同じポーズを取っている。水産大学校時代の恩師である国本正彦先生に、「目立つことはしないように」と幾度となく（少なくとも3回）釘を刺されているのに、すぐに調子に乗ってしまう（北海道弁で言う「おだった」ヤツ）。言いつけを守らず申し訳ありません。体が反応してしまうのです。多分、遺伝です。

 

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